В смутное время монастырь сыграл огромную роль в консолидации русских сил. Обитель выдержала 16-месячную (1608-1609 гг.) осаду войск Сапеги и Лисовского, по молитвам преподобного Сергия Радонежского мужественно отражая приступы неприятеля. Защищали монастырь от 15-тысячной армии Лжедмитрия II 2400 стрельцов, дворян их слуг и монахов. Все приступы были отбиты.
Настоятель монастыря архимандрит Дионисий (Ржевитин) и келарь Авраамий Палицын в письмах-грамотах поднимали дух русского воинства, убеждали собрать силы для защиты Москвы. Сергиева обитель пожертвовала на защиту Отечества драгоценные вещи из ризницы и значительные денежные суммы, принимала у себя раненых. В эти смутные годы святая обитель поистине стала оплотом русской национальности, она влила веру и мужество в сердца русского народа и много способствовала освобождению России от иноземцев.